ЩО ТАКЕ МЕТОД ПЛР У РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ ТА ЯКА ЙОГО СУТЬ?

1. Введення

Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) є одним із найшвидших та найефективніших способів ампліфікації (множення) ДНК. Він дозволяє розмножити особливі фрагменти ДНК у великі кількості для подальшого дослідження, і став популярним інструментом у багатьох наукових галузях, таких як генетика, медицина та біологія. У цій статті ми розглянемо основні аспекти методу ПЛР у реальному часі та розкриємо його сутність.

2. Основи методу ПЛР

Метод ПЛР був розроблений в 1983 році Карі Мюллісом та став краєвідомим у науці. Він базується на здатності ферменту рНК-полімерази копіювати двострунну ДНК в ланцюги однокаліцних ДНК. Основною метою ПЛР є створення багатокопійних копій конкретного фрагменту ДНК.

2.1 Реакційна суміш

Для проведення методу ПЛР потрібна реакційна суміш, яка містить наступні компоненти:

• Матрична ДНК, що містить фрагмент, який потрібно розмножити;
• ДНК-полімеразу, яка відповідає за копіювання ДНК;
• Олігонуклеотидні праймери (короткі штучно синтезовані одноланцюгові олігонуклеотиди), які служать початком ампліфікації фрагментів ДНК;
• Дезоксинуклеотиди (dNTPs), які є будівельними блоками для створення нових стрічок ДНК;
• Буферна суміш для забезпечення оптимальних умов для реакції;
• Магній інактиватор (MgCl2), що забезпечує каталітичну активність ДНК-полімерази;
• Та спеціальну реакційну змішувач із забарвлювачем для виявлення результатів ампліфікації.

2.2 Етапи реакції

Метод ПЛР складається з трьох основних етапів:

1. Денатурація: Двострунна ДНК розтоплюється за високої температури (95°C), де її ланцюги розділяються і утворюються праймери.
2. Аннелірование: Реакційна суміш охолоджується до температури, при якій праймери аннеліруються (прикріплюються) до початку і кінця фрагменту ДНК.
3. Подовження: При підвищенні температури до 72°C, ДНК-полімераза додає дезоксинуклеотиди до прикріплених праймерів, що призводить до створення нових ланцюгів ДНК.

3. ПЛР у реальному часі

ПЛР у реальному часі (qPCR) є посиленою версією методу ПЛР, в якому динаміка ампліфікації ДНК може бути відслідкована в реальному часі. Це дає змогу вимірювати точну кількість копій ДНК в початковій суміші. Використовуючи спеціальні флюоресцентні зонди, реакція qPCR має найвищу чутливість та точність, що дозволяє виявити навіть дуже низькі рівні ДНК.

3.1 Флюоресцентні зонди

Одним із ключових компонентів qPCR є флюоресцентні зонди, які світяться при ампліфікації ДНК. Ці зонди містять флюорохромний крій, який прикріплюється до проміжку між праймерами. Під час подовження праймерами, фермент ДНК-полімераза долає цей проміжок, розщеплюючи флюорохромний крій і підтверджуючи ампліфікацію. Оскільки флюоресценція вимірюється на кожному циклі ампліфікації, можна стежити за збільшенням кількості копій ДНК в реальному часі.

4. Застосування методу ПЛР у реальному часі

qPCR має широкий спектр застосувань і використовується у багатьох галузях науки та медицини:

• Генетичні дослідження: qPCR дозволяє визначити генетичні варіації, сліди злочинів та виявити генетичні захворювання.
• Діагностика захворювань: qPCR використовується для виявлення вірусів, бактерій та інших мікроорганізмів, що сприяє своєчасній та точній діагностиці захворювань.
• Агробіотехнологія: qPCR допомагає виявити генетичні зміни в сільськогосподарських культурах, що сприяє покращенню їхньої продуктивності та стійкості до шкідників та хвороб.
• Фармацевтика: qPCR використовується для моніторингу ефективності ліків та розробки нових лікарських препаратів.

5. Висновок

Метод ПЛР у реальному часі є потужним та універсальним інструментом у науці та медицині. Він дозволяє швидко й точно розмножувати фрагменти ДНК для досліджень та діагностики. qPCR забезпечує надзвичайну чутливість та точність, дозволяючи виявити навіть надзвичайно низькі рівні ДНК. Застосування методу ПЛР у реальному часі широко розповсюджене і має безліч корисних застосувань у різних галузях науки та медицини.

5 запитань, що часто задаються про метод ПЛР у реальному часі:

1. Як точно працює метод ПЛР в реальному часі?
2. Які компоненти потрібні для проведення qPCR?
3. Для яких галузей науки та медицини є корисним застосування методу ПЛР у реальному часі?
4. Які переваги має qPCR над звичайним методом ПЛР?
5. Як вимірюється кількість копій ДНК під час ампліфікації в qPCR?

Залишити коментар

Опубліковано Максим на 14 02 2024. Поданий під Відповідь. Ви можете слідкувати за будь-якими відповідями через RSS 2.0. Ви можете подивитись до кінця і залишити відповідь.