Полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі

Полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі (ПЛР у реальному часі) або кількісна ПЛР (qPCR) – це метод молекулярної біології, який використовується для кількісного визначення специфічного фрагмента ДНК у зразку. Ця техніка є підтипом традиційної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), але дозволяє проводити вимірювання в реальному часі під час процесу ампліфікації.

Принцип дії

ПЛР у реальному часі базується на принципі традиційної ПЛР з деякими ключовими відмінностями:

• Ампліфікація у реальному часі: На відміну від звичайної ПЛР, де ампліфікація всіх циклів відбувається в кінці, ПЛР у реальному часі вимірює кількість продукту ампліфікації кожного циклу в процесі.
• Флуоресцентна детекція: У реакційну суміш ПЛР у реальному часі додають флуоресцентні зонди, які випромінюють флуоресценцію при зв'язуванні з ампліфікованою ДНК.
• Виявлення флуоресценції: Флуоресценція виявляється спеціальним приладом, який спостерігає за змінами сигналу під час ампліфікації.

Використання ПЛР у реальному часі

ПЛР у реальному часі має широкий спектр застосувань, включаючи:

• Кількісна оцінка експресії генів: Вимірює кількість копій певних генів у зразку, що дозволяє досліджувати рівні генної експресії.
• Діагностика інфекційних захворювань: Виявляє та кількісно визначає патогенні організми, такі як бактерії, віруси та гриби.
• Генетичні тести: Виявляє мутації, варіації та інші генетичні зміни.
• Харчова безпека: Перевіряє наявність харчових патогенів для забезпечення безпечності продуктів харчування.
• Екологічний моніторинг: Виявляє та кількісно визначає організми в навколишньому середовищі, оцінюючи біорізноманіття та екосистемні послуги.

Перевага ПЛР у реальному часі

• Кількісне визначення: Надає кількісну інформацію про кількість ампліфікованої ДНК, дозволяючи порівнювати зразки та оцінювати рівні експресії.
• Чутливість: Високочутливий метод, який може виявити навіть невеликі кількості ДНК.
• Специфічність: Високоспецифічний метод, який дозволяє націлювати і ампліфікувати лише певний фрагмент ДНК.
• Швидкість: Завершується швидше, ніж традиційна ПЛР, оскільки не потрібен додатковий аналіз продукту ампліфікації.
• Потужна автоматизація: Може бути автоматизована, що дозволяє проводити високопродуктивне тестування.

Обмеження ПЛР у реальному часі

• Дороговизна: Більш дорога, ніж традиційна ПЛР через вартість обладнання та реагентів.
• Непряме визначення: Надає кількісну інформацію про ампліфіковану ДНК, яка може не завжди точно відображати кількість мРНК або білка.
• Вплив інгібіторів: Інгібітори в зразку можуть вплинути на результати ПЛР у реальному часі.
• Забруднення продуктами ПЛР: Можливе забруднення реакційних сумішей продуктами ПЛР з попередніх реакцій.
• Складність оптимізації: Потребує ретельної оптимізації, щоб гарантувати специфічність, ефективність та відсутність інгібіторів.

Полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі є потужним методом молекулярної біології, який дозволяє кількісно визначити специфічні фрагменти ДНК в реальному часі. Вона має широкий спектр застосувань у різних галузях, включаючи біомедичні дослідження, діагностику захворювань та екологічний моніторинг. Незважаючи на деякі обмеження, ПЛР у реальному часі залишається цінним інструментом для кількісного аналізу ДНК.

Поширені запитання

• Що таке ПЛР у реальному часі?
  ПЛР у реальному часі – це метод, який дозволяє виміряти кількість ДНК у зразку в реальному часі під час процесу ампліфікації.
• Чим ПЛР у реальному часі відрізняється від звичайної ПЛР?
  ПЛР у реальному часі дозволяє проводити вимірювання в реальному часі, тоді як звичайна ПЛР вимірює кінцевий продукт після завершення ампліфікації.
• Які переваги ПЛР у реальному часі?
  ПЛР у реальному часі є кількісною, чутливою та високоспецифічною.
• Які обмеження ПЛР у реальному часі?
  ПЛР у реальному часі є дорожчою, непрямою та чутливою до інгібіторів.
• Як оптимізувати ПЛР у реальному часі?
  Оптимізація ПЛР в реальному часі включає ретельний вибір праймерів, оптимізацію умов реакції та використання відповідних стандартів.

Залишити коментар

Опубліковано Максим на 02 05 2024. Поданий під Вікі. Ви можете слідкувати за будь-якими відповідями через RSS 2.0. Ви можете подивитись до кінця і залишити відповідь.